przychodnia topolowa lublin ortopeda

Podwójnie wybarwione sekcje analizowano przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Kontrolne preparaty traktowane PBS zamiast pierwotnych Abs nie wykazywały barwienia. Barwienie immunofluorescencyjne dla białek macierzy i makrofagów. Monoklonalna mysia dodatnia domena komórkowa fibronektyny dodatnia (FN-EDA +) (Harlan Sera-Lab Ltd., Loughborough, Wielka Brytania), królicze anty-mysie lamininy (ICN Immunobiologicals, Aurora, Ohio, USA), koza przeciw ludzkiemu typowi I kolagen i kozowy anty-ludzki kolagen typu III (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Alabama, USA) zastosowano jako pierwszorzędowe Ab do wykrycia składników macierzy w kłębuszkach w d6. Sprzężone z FITC szczurze F (ab.) 2 anty-mysie IgG (H + 1) (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), sprzężone z FITC świńskie anty-królicze IgG (DAKO Corp.) i skoniugowane z FITC królicze anty-kozie IgG (DAKO Corp.) zostały użyte jako wtórne Ab. Do immunobarwienia fibrynogenu / fibryny zastosowano bezpośrednio sprzężony z FITC króliczego antyludzkiego fibrynogenu / fibryny (DAKO Corp.). W celu określenia infiltracji monocytów / makrofagów do kłębuszków zastosowano sprzężony z FITC mysi anty-szczurzy ED-1 Ab (Serotec Ltd., Oxford, Wielka Brytania). Odkładanie wewnątrzkomórkowe tych składników ECM oceniono ilościowo przez zsumowanie 20 losowo wybranych kłębków nerkowych w każdej sekcji w skali 0. 4, jak opisano powyżej. Liczbę monocytów / makrofagów na kłębuszek zliczano w 20 kłębuszkach wybranych losowo na sekcję. TGF-P i zawartość fibronektyny w kłębuszkach nerkowych. Glomeruli od poszczególnych szczurów izolowano i ponownie zawieszano w 2 x 104 kłębuszkach / ml w buforze RIPA (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% dezoksycholanu, 0,1% SDS i tabletka / 5 ml mieszaniny inhibitorów proteazy [Complete, mini; Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, Indiana, USA]). Glomeruli homogenizowano dwukrotnie na lodzie metodą sonikacji. Po każdej 15-sekundowej sonikacji następowało 15-sekundowe ochłodzenie. Po odwirowaniu przy 400 g przez 10 minut w 4 ° C, supernatant przechowywano w temperaturze <70 ° C aż do analizy zawartości kłębuszkowej TGF-pi i fibronektyny. Zawartość TGF-P mierzono po aktywacji kwasem przy użyciu dostępnego w handlu systemu opracowywania DuoSet ELISA (Quantikine; R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Zawartość fibronektyny mierzono zmodyfikowanym hamującym ELISA według opublikowanych metod (48). Przygotowanie RNA i hybrydyzacja Northern. Całkowity RNA ekstrahowano bezpośrednio ze świeżo wyizolowanych kłębuszków metodą izotiocyjanianu guanidyny, stosując odczynnik Trizol (Invitrogen, Gaithersburg, Maryland, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Izolowane kłębuszki z dziesięciu szczurów połączono do późniejszej ekstrakcji RNA. W przypadku analizy Northern, RNA zdenaturowano i frakcjonowano przez elektroforezę przez 1,0% żel agarozowy (30 .g / ścieżkę) i przeniesiono na membranę nylonową BrightStar-plus (Ambion Inc., Austin, Texas, USA). Kwasy nukleinowe unieruchomiono naświetlaniem UV. Błony wstępnie prehybrydyzowano roztworem ULTRAhyb (Ambion Inc.) i hybrydyzowano z sondami DNA (1 x 106 cpm / ml) znakowanymi 32P-dATP przy użyciu zestawu do sondowania DNA i zestaw do usuwania sondy DNA (Proud Pramed StripAble) (Ambion Inc.). Bloty przemywano w 2 x SSC z 0,1% SDS w 42 ° C przez 10 minut i w 0,1 x SSC z 0,1% SDS w 42 ° C przez 20 minut. Stosowano sondy DNA: cDNA GAPDH, prezent od P. Kondaiah i MB Sporn, Dartmouth University, Hanover, New Hampshire, USA (49); CDNA TGF-a1, dostarczone przez HL Moses, Vanderbilt University Cancer Center, Nashville, Tennessee, USA (50); CDNA PAI-1, dostarczone przez TD Gelehrter, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA (51); FN-EDA + cDNA, hojny prezent od RO Hynes, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA (52); i kolagen typu I, dostarczone przez Phillip Gray, University of Utah, Salt Lake City, Utah, USA (53) [przypisy: przychodnia topolowa lublin, sla objawy, świadomy sen techniki ]