omron pomiar tkanki tłuszczowej

Pożywki hodowlane składały się z pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 8% FCS, 8% mysiej suplementu hodowli IL-3 (Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massachusetts, USA), 20 mM HEPES, 4 mM L-glutaminy, 0,08 U / ml penicyliny, 0,08 U / ml streptomycyny, 800. M nieistotnych aminokwasów, 800. M pirogronianu sodu, 0,04 mg / ml gentamycyny i 92. M. -Merkaptoetanolu. Hodowle komórkowe utrzymywano w stałej temperaturze 37 ° C w wilgotnej komorze zawierającej 5% CO2. Komórki adherentne (makrofagi, monocyty) zubożono w hodowli przez przeniesienie komórek w zawiesinie do świeżych pożywek co tydzień w stężeniu x 105 do 5 x 105 komórek / ml. Test z heksosaminidazą. Komórki tuczne inkubowano przez noc w 37 ° C z monoklonalnym mysim anty-DNP IgE (klon SPE-7, Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, USA) w stężeniu 100 ng / ml na milion komórek, uzyskując 100% zajętość receptorów IgE. Komórki przemyto dwukrotnie solą glukozową, pożywką buforowaną przez Pipę zawierającą mM wapń (bufor Siraganiana, również z KCl, MgCl2, BSA [pH 7,2]) i przeniesiono do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania w stężeniu 500 000 komórek na 75 L. Komórki inkubowano z lub bez adenozyny przez minutę przed stymulacją antygenem (albumina DNP, 10 ng / ml, Sigma Chemical Co.). Reakcje zakończono po 20 minutach przez odwirowanie próbek w 4 ° C przy 2000 g przez 5 minut. Wydzielanie heksoaminidazy oznaczano przez inkubację supernatantu i lizatu komórkowego za pomocą mM p-nitrofenylo-N-acetylo-a-D-glukozaminidu (p-NAG, ciężar cząsteczkowy 342,3, Sigma Chemical Co.). Po 1-godzinnej inkubacji w 37 ° C dodano 0,1 M Na2CO3 / NaHCO3 i odczytano absorbancję przy 405 nm. Uwalnianie heksozoaminidazy wyrażono jako procent całkowitej ilości heksozoaminidazy obecnej w komórkach. Śródskórna adenozyna i inozyna. Myszom wstrzyknięto dożylnie 100 .l 1% błękitu Evansa (Sigma Chemical Co.) w PBS. Godzinę później znieczulono i podano 20. L adenozyny (10. 3. 10. 4 M) lub inozyny (10. 4 M) i 20. L PBS odpowiednio w prawym i lewym uchu. Jedną godzinę po wstrzyknięciach śródskórnych myszy uśmiercono przez przemieszczenie kręgów szyjnych i z każdego ucha otrzymano 7-mm dziurkacze. Niebieski barwnik Evans ekstrahowano przez inkubację w 0,5 ml formamidu w temperaturze 55 ° C przez 48 godzin i oznaczono ilościowo przez pomiar absorbancji błękitu Evansa przy 610 nm za pomocą spektrofotometru (35). Analiza histologiczna. Narządy pobierano od A3AR + / + i A3AR. /. myszy i utrwalone w 10% formalinie. Tkanki zatopiono w parafinie, a wycinki o masie 5 urn cięto i barwiono błękitem toluidynowym. Liczby mastocytów w każdej tkance oznaczono ilościowo w sposób zaślepiony, zliczając liczbę pozytywnie wybarwionych komórek w każdej tkance od 3 zwierząt z każdego genotypu. Pasywna anafilaksja skórna. Pasywną skórną anafilaksję przeprowadzono jak opisano wcześniej (36). Pokrótce, zwierzęta lekko znieczulono i wstrzyknięto śródskórnie w prawe ucho 20 ng mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-DNP IgE rozcieńczonego w 20 ul PBS. Do lewego ucha wstrzyknięto sam PBS. Dwadzieścia cztery godziny później zwierzęta wstrzyknięto dożylnie 100 .g albuminy DNP w 100 .l 0,9% PBS; Dodano 1% niebieskiego barwnika Evans, aby umożliwić wizualne zlokalizowanie zwiększonej przepuszczalności naczyń. Reakcję oceniano ilościowo po 90 minutach od wstrzyknięcia, jak już tu opisano. Pasywna anafilaksja układowa. Przeprowadzono pasywną anafilaksję układową, jak opisano wcześniej (37). W skrócie, zwierzętom wstrzyknięto dożylnie 200 .l PBS zawierającego 20 .g mysich monoklonalnych przeciwciał anty-DNP IgE, a 24 godziny później 200 .l PBS zawierającego 1% błękit Evansa i mg DNP-albuminy. Zwierzęta kontrolne otrzymywały jedynie antygen lub IgE
[więcej w: zapadnięte płuco, fenfluramina, opiszcie swój pierwszy raz ]